一、假病毒簡(jiǎn)介

慢病毒：慢病毒（Lentivirus，LV）是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

腺病毒：腺病毒(Adenovirus，ADV)是一種沒有包膜的直徑為70～90 nm的病毒顆粒，具有較強(qiáng)的細(xì)胞和組織感染能力，腺病毒載體能夠攜帶大容量的基因片段，適用于短時(shí)間內(nèi)高表達(dá)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，可以快速獲得目的產(chǎn)物，效率高。

腺相關(guān)病毒:腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）,也稱腺伴隨病毒,屬于微小病毒科依賴病毒屬,是目前發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的單鏈DNA缺陷型病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復(fù)制。研究過程中采用的重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV) 源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣(分裂和非分裂細(xì)胞)、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應(yīng)用。

二、慢病毒的儲(chǔ)存和稀釋

 1：儲(chǔ)存條件：-80℃可保存12個(gè)月左右，如果超過12個(gè)月，則病毒滴度下降可能較多，最好再使用前重新做滴度測(cè)定。4℃一般可儲(chǔ)存1-2周。注意：慢病毒使用時(shí)要注意避免反復(fù)凍融，如需要多次使用，請(qǐng)將病毒分裝后儲(chǔ)存在-80℃。

2：慢病毒稀釋：在使用前，將慢病毒冰浴融化或4℃冰箱融化，融化后放置在冰盒上備用。用完全培養(yǎng)基或

PBS稀釋。稀釋后的病毒請(qǐng)立即使用，不建議再分裝凍存。

3：泰斯拓生物提供的慢病毒滴度單位為TU/ml，即每毫升慢病毒液中含有具有生物活性的慢病毒顆粒數(shù)。“TU”為“Transducing-Units”的縮寫，中文為轉(zhuǎn)導(dǎo)單位，表示可以感染并進(jìn)入到目標(biāo)細(xì)胞群中的病毒基因組數(shù)。如：病毒滴度為1×108TU/ml，即每毫升病毒液中含有1×108個(gè)具有生物活性的病毒顆粒。

三、特殊細(xì)胞感染注意事項(xiàng)

1：懸浮細(xì)胞

懸浮細(xì)胞感染可以采用離心感染法，在培養(yǎng)皿中加入病毒后，可以將培養(yǎng)板子密封，然后使用水平轉(zhuǎn)子1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這樣可以增加病毒與懸浮細(xì)胞的接觸概率，從而提高感染效率。

2：極難感染的細(xì)胞

有些細(xì)胞很難感染，那么單次感染之后的效率很低的情況下，可以采用多次反復(fù)感染的方法來提高感染效率，即在進(jìn)行一次感染之后，重新加入新鮮病毒再次感染，一般在加強(qiáng)感染之后，可以顯著提高細(xì)胞的感染效率。但在兩次感染之間，要注意調(diào)整好細(xì)胞狀態(tài)，因?yàn)椴《驹诟腥炯?xì)胞之后是存在細(xì)胞毒性的，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

3：原代細(xì)胞

對(duì)于原代細(xì)胞，一般細(xì)胞生長(zhǎng)比較緩慢，且其傳代能力較差，所以在接種的時(shí)候，可以提高細(xì)胞密度在50%以上。

4：非分裂細(xì)胞

對(duì)于一些非分裂細(xì)胞，其復(fù)蘇或接種后細(xì)胞不再分裂增殖，所以在進(jìn)行感染時(shí)，細(xì)胞的密度得在80%以上，所以在復(fù)蘇或者接種時(shí)就得注意把細(xì)胞密度鋪在80%以上。

最適MOI預(yù)實(shí)驗(yàn)

5：貼壁細(xì)胞

（1）感染前一天，用胰酶消化目的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)基體積為100µl，使得第二天進(jìn)行病毒感染時(shí)的細(xì)胞匯合度20-30%左右。對(duì)于大部分細(xì)胞，我們通常認(rèn)為培養(yǎng)24h后細(xì)胞數(shù)量是鋪板數(shù)量的兩倍。

（2）MOI值的設(shè)置若有文獻(xiàn)參考，可以參考值為中心設(shè)置梯度覆蓋參考值；若無文獻(xiàn)參考可按照MOI 1，10，50，100設(shè)置MOI梯度進(jìn)行摸索。

（3）根據(jù)細(xì)胞數(shù)，按照MOI 1，10，50，100計(jì)算出需要加入的病毒滴度（最適MOI預(yù)實(shí)驗(yàn)一般選用熒光對(duì)照病毒），然后使用含有終濃度為8ug/ml左右的polybrene（Cat.TA003）的完全培養(yǎng)基在對(duì)應(yīng)的EP管里進(jìn)行稀釋，總體積為100µl。吸掉各孔中上清液，更換為稀釋好的不同MOI的病毒液，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后24h后用完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液，過程中觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)生變化時(shí)可以提前到8h換液，保持細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

（4）感染后約72h，觀察感染效率。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，選擇合適時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。可按照實(shí)際感染情況，校正MOI。

（5）最適MOI的選擇原則：1）：細(xì)胞狀態(tài)不受影響，2）：盡量用較少的病毒，3）：選擇感染效率80%左右的感染條件作為最佳感染條件。

6：懸浮細(xì)胞

（1）感染前一天，制備懸浮細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度約為1*10^5個(gè)/ml將細(xì)胞接種到96孔板。

（2）MOI值的設(shè)置若有文獻(xiàn)參考，可以參考值為中心設(shè)置梯度覆蓋參考值；若無文獻(xiàn)參考可按照MOI 1，10，50，100設(shè)置MOI梯度進(jìn)行摸索。

（3）根據(jù)細(xì)胞數(shù)，按照MOI 1，10，50，100計(jì)算出需要加入的病毒滴度（最適MOI預(yù)實(shí)驗(yàn)一般選用熒光對(duì)照病毒），然后使用含有終濃度為16µg/ml左右的polybrene（Cat.TA003）的完全培養(yǎng)基在對(duì)應(yīng)的EP管里進(jìn)行稀釋，總體積為100µl。然后將不同MOI的病毒稀釋液加到對(duì)應(yīng)的96孔中，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后24h后再加入100µl完全培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞正常生長(zhǎng)，過程中觀察細(xì)胞形態(tài)。

（4）感染后約72h，觀察感染效率。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，選擇合適時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。可按照實(shí)際感染情況，校正MOI。

（5）最適MOI的選擇原則：1）：細(xì)胞狀態(tài)不受影響，2）：盡量用較少的病毒，3）：選擇感染效率80%左右的感染條件作為最佳感染條件。